正就读中学的少年迈尔斯（沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音）意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬伤，随后身体发生奇特的变化。偶然机缘，他目睹了蜘蛛侠（杰克·约翰逊 Jake M. Johnson 配音）和犯罪头目金并（列维·施瑞博尔 Liev Schreiber 配音）的战斗。为了阻止金并利用时空对撞机扰乱宇宙，蜘蛛侠最终壮烈牺牲。可未过多久，来自平行宇宙的颓废的彼德·帕克出现在迈尔斯面前。为了阻止金并的阴谋，并帮助这个帕克返回自己的宇宙，他们闯入金并的老巢。在这一过程中，二人遭到章鱼博士和徘徊者的狙击。与此同时，来自其他宇宙的女蜘蛛侠、暗影蜘蛛侠、蜘猪侠、二次元蜘蛛妹相继出现。 他们合力与恶势力展开斗争……

在《奇奇与蒂蒂：救援突击队》电视动画结束30年后，奇奇成为了一个过着枯燥生活的保险业务员，蒂蒂则动了CGI手术让自己变成时下的3D动画造型，到处参加影迷活动回味着往日的辉煌；就在此时，针对动画人物的绑架事件接二连三的发生，当受害者中出现昔日同伴的名字时，奇奇与蒂蒂阔别多年的联手，试图找出真相与挽回破裂多年的友情。

影片讲述了新生代蜘蛛侠迈尔斯·莫拉莱斯（沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音）携手蜘蛛格温·斯泰西（海莉·斯坦菲尔德 Hailee Steinfeld 配音），穿越多元宇宙踏上更宏大的冒险征程的故事。面临每个蜘蛛侠都会失去至亲的宿命，迈尔斯誓言打破命运魔咒，找到属于自己的英雄之路。而这个决定和米格尔·奥哈拉（奥斯卡·伊萨克 Oscar Is aac 配音）所领军的蜘蛛联盟产生了极大冲突，一场以一敌百的蜘蛛侠大内战即将拉响！